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GBT18204.10-2000 游泳池水微生物檢驗(yàn)方法大腸菌群測(cè)定.pdf
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了游泳池水大腸菌群的測(cè)定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于游泳池水大腸茵群的測(cè)定。
2引用標(biāo)準(zhǔn)
下列標(biāo)準(zhǔn)所包含的條文,通過(guò)在本標(biāo)準(zhǔn)中引用而構(gòu)成為本標(biāo)準(zhǔn)的條文。本標(biāo)準(zhǔn)出版時(shí),所示版本均為有效。所有標(biāo)準(zhǔn)都會(huì)被修訂,使用本標(biāo)準(zhǔn)的各方應(yīng)探討使用下列標(biāo)準(zhǔn)***新版本的可能性。
GB/T 18204. 2- 2000 公共 場(chǎng)所茶具微生物檢驗(yàn)方法大腸菌群測(cè)定
3定義
本標(biāo)準(zhǔn)采用下列定義。
大腸菌群coliform bacteria
指一群在36'C士1C培養(yǎng)24 h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。
第一法多管發(fā)酵 法.
4儀器
見(jiàn)GB/T 18204. 2--2000中第3章。
5培養(yǎng)基和試劑
5.1乳糖蛋白胨培養(yǎng)液
5.1.1 成分:蛋白胨 10 g
牛肉膏 3g
乳糖 5g
氯化鈉 5g
1.6%(V/V)溴甲酚紫乙醇溶液 1 mL
蒸餾水 1000 mL
5.1.2 配法:將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉置于1 000 mL蒸餾水中加熱溶解,調(diào)pH到7.2~7.4。
5.1.2 配法:將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉置于1 000 mL蒸餾水中加熱溶解,調(diào)pH到7.2~7.4。
再加入1 mL1. 6%溴甲酚指示劑,充分混勻,分裝到含有倒管的試管中,115C高壓滅菌15 min.
5.2 伊紅美蘭瓊脂
見(jiàn)GB/T18204.3~-2000中第4章第2節(jié)。
5.3 革蘭氏染色液
見(jiàn)GB/T 18204.3- 2000中第4章第4節(jié)。
5.4染色法
見(jiàn)GB/T 18204.3- -2000 中第4章第5節(jié)。
6推測(cè)性試驗(yàn)
6.1在2個(gè)裝有50mL三倍濃縮乳糖膽鹽培養(yǎng)液的大試管或燒杯內(nèi)各加入水樣100mL.
6.2在10支裝有5mL三倍濃縮乳糖膽鹽培養(yǎng)液的試管里各加入水樣10mL。
6.3輕搖試管,使液體充分混勻,置 36"C士1C培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h。
6.4觀(guān)察每管是***產(chǎn)氣,如不產(chǎn)氣則報(bào)告為大腸茵群陰性;若有氣體產(chǎn)生則為推測(cè)性試驗(yàn)陽(yáng)性,需做進(jìn)--步的證實(shí)試驗(yàn)。
7證實(shí)試驗(yàn)
7.1平板分離
自推測(cè)性檢驗(yàn)陽(yáng)性管中取一接種環(huán)培養(yǎng)液,接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上,置36'C土1C培養(yǎng)箱培養(yǎng)18~24h,觀(guān)察菌落形態(tài),典型的大腸菌群菌落為黑紫色或紅紫色,具有金屬光澤。
7.2復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)挑取可疑大腸菌群菌落1或2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色,同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管,于36"C士+1C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h.
7.3凡乳糖 發(fā)酵管***終產(chǎn)酸、產(chǎn)氣,革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽胞桿菌,為大腸菌群陽(yáng)性。記下證實(shí)試驗(yàn)的陽(yáng)性管數(shù),查總大腸菌群(MPN)檢索表得出1000mL水樣中總大腸菌群的MPN值。
表1總大腸菌群(MPN)檢索表
第二法濾膜法
8儀器
8.1 濾器。
8.2 濾膜;孔徑0.45 um。直徑根據(jù)濾器規(guī)格,目前常用的有35 mm和47 mm兩種。
8.3抽濾設(shè) 備。
8.4無(wú)齒鑷子。
8.5 其他儀器見(jiàn)GB/T 18204.2--2000中第3章。
9培養(yǎng)基
9.1品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基
9.1.1 成分:
蛋白胨 10g
酵母浸膏 5g
牛肉膏 5g
乳糖 10g
瓊脂 10-20g
磷酸氫二鉀 3.5g
無(wú)水亞硫酸鈉 5g
5%堿性品紅乙醇溶液20 mL
蒸餾水 1000ml
9.1.2儲(chǔ)備培養(yǎng)基的制備
將磷酸氫二鉀、酵母浸膏、牛肉膏及蛋白胨加到含有900 mL蒸餾水的燒杯中,溶解后調(diào)pH值到
7. 2~7.4,加人瓊脂加熱溶解,用蒸餾水補(bǔ)足至1 000 mL,趁熱用脫脂棉或絨布過(guò)濾,再加人乳糖,混勻
9.1.3平皿培養(yǎng)基的制備
9.1.3平皿培養(yǎng)基的制備
將上述培養(yǎng)基加熱融化,根據(jù)培養(yǎng)基的用量,堿性品紅乙醇溶液與培養(yǎng)基按1↑50的比例,用滅菌另一個(gè)滅蔭空試管內(nèi).加滅菌水少許使其溶解,在沸水浴中煮沸滅菌10 min。另一個(gè)滅蔭空試管內(nèi).加用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液,滴加于堿性品紅乙醇溶液至深紅色褪成淡粉紅色為止。將滅菌水少許使其溶解,在沸水浴中煮沸滅菌10 min。
此亞硫酸鈉與堿性品紅的混合液全部加入已融化的儲(chǔ)備培養(yǎng)基中,并充分混勻(防止產(chǎn)生氣泡),立即將此種培養(yǎng)基適量?jī)A人滅菌的空平皿內(nèi),待其冷卻凝固后置冰箱內(nèi)備用。此培養(yǎng)基于冰箱中保存不宜超過(guò)兩周，如培養(yǎng)基已由淡紅色變成深紅色,則不能再用。
9.2乳糖蛋白胨培養(yǎng)液
10 操作步驟
10.1濾膜滅 菌:將濾膜放人含蒸餾水的燒杯中,煮沸滅菌三次,每次15 min。前兩次煮沸后需更換水洗滌2~3次,以除去殘留溶劑。
10.2 濾器滅菌:用121C商壓滅菌20 min或用點(diǎn)燃的酒精棉球火焰滅菌。
10.3 水樣過(guò)濾:用無(wú)菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分,將粗糙面向上,貼放在濾床上。固定好濾器,將X10' Pa(-0.5大氣壓)下抽濾。X10' Pa(-0.5大氣壓)下抽濾。
10.4 培養(yǎng):水樣濾完后,再抽氣約5s,關(guān)上濾器閥門(mén),取下濾器。用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分,移放在乳糖瓊脂分離培養(yǎng)基上,濾膜截留細(xì)菌面向上,濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊,兩者之間不得留有氣泡。然后將平皿倒置,放人36C士1C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18~24 h.
10.5挑取濾膜上符合下列特征的茵落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。
紫紅色,具有金屬光澤的菌落;
深紅色,不帶或略帶金屬光澤的菌落;
淡紅色,中心色較深的菌落。
10.6 將革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽胞桿菌接種到乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中.于36C士1C培養(yǎng)48h.產(chǎn)酸產(chǎn)氣者證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性。
11 檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告
計(jì)算濾膜上生長(zhǎng)的證實(shí)為大腸菌樣的菌落數(shù),再乘以10即為每1000mL水樣中的大腸菌群數(shù)。
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