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GBT 18204.4-2013 公共場所衛(wèi)生檢驗方法 第4部分：公共用品用具微生物.pdf
1、范圍
GB/T 18204的本部分規(guī)定了公共場所公共用品用具細菌總數(shù)、真菌總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌的采樣與測定方法。
本部分適用于公共場所內(nèi)公共用品用具細菌總數(shù)、真菌總數(shù)、大腸菌群、金黃葡萄球菌以及溶血性鏈球菌的測定,其他場所可參照執(zhí)行。
2、術(shù)語和定義
下列術(shù)語和定義適用于本文件。
2.1
細菌總數(shù)total bacterial count
公共用品用具經(jīng)過采樣處理,在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)35℃～37 ℃,48 h培養(yǎng)所生長發(fā)育的嗜中溫性需氧和兼性厭氧菌落的總數(shù)。
2.2
大腸菌群coliforms
在37 ℃,24 h培養(yǎng)能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣.需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌2.3
金黃色葡萄球菌staphylococcus aureus
在Baird Parker培養(yǎng)基或血平板培養(yǎng)基上生長良好,分解甘露醇產(chǎn)酸,血漿凝固酶陽性的革蘭氏陽性葡萄狀球菌。
2.4
真菌總數(shù)total fungi count
在孟加拉紅或沙氏瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)25笆?28 °C、3 d?7 d培養(yǎng)所形成菌落的總數(shù)。
2.5
溶血性鏈球菌 streptococcus hemolyticus
屬于鏈球菌屬，為革蘭氏陽性菌，分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，血平板上產(chǎn)生溶血圈。
在孟加拉紅或沙氏瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)25 ℃~28 ℃、3 d~7 d培養(yǎng)所形成菌落的總數(shù)。
3、細菌總數(shù)平皿計數(shù)法
3.1培養(yǎng)基與試劑
3.1.1 生理鹽水成分:
氯化鈉 8.5 g
蒸餾水 1 000 mL
制法:稱取8.5 g氯化鈉溶于1000 mL蒸餾水中,分裝到試管內(nèi),每管10 mL,121℃高壓滅菌15 min。
3.1.2營養(yǎng)瓊脂成分：
蛋白臉
牛肉膏
氯化鈉
瓊脂
蒸餡水
制法:將上述成分混合后，加熱溶解，調(diào)整pH為7. 4?7.6,分裝于玻璃容器內(nèi)，經(jīng)103.43 kPa （121 °C ,15 lb）滅菌20 min,儲存于冷暗處備用。
3.2儀器和設(shè)備
高壓蒸汽滅菌器°
樣品的稀釋:將放有采樣后棉拭子的試管充分振搖,此液為1 ： 10的樣品勻液。用1 mL無菌吸 管或微量移液器吸取1 ： 10樣品勻液1 mL,沿管壁緩慢注于盛有9 mL生理鹽水稀釋液（3.1.1）的無菌 試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均 勻，制成1 : 100的樣品勻液。按同法制備10倍系列稀釋祥品勻液，每遞增稀釋1次，換用1次1 mL無 菌吸管或吸頭。
3.3.3樣品的接種:根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇1個?2個適宜稀釋度的樣品勻液,在進行10倍 遞增稀釋時,每個稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液于2個無菌平皿內(nèi)。同時分別取1 mL稀釋液加入兩 個無菌平皿作空白對照。
334樣品的培養(yǎng)：及時將15 mL?20 mL冷卻至45 °C?50 °C的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于 46 °C±1 °C恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)， 36 °C±1 °C培養(yǎng) 48 h±2 h。
干熱滅菌箱。
恒溫培養(yǎng)箱：36笆士1 °C。
冰箱。
電爐或微波爐。
天平:感量0.1 go 渦旋混合器。
無菌試管、平皿（直徑9 cm）、刻度吸管等& 滅菌棉拭子。
滅菌剪刀。
pH計或精密pH試紙。
放大鏡或（和）菌落計數(shù)器。
3.3檢驗步驟
3.4菌落計數(shù) 3.4.1可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量（CFU）。
3.4.2選取菌落數(shù)在30 CFU?300 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30 CFU 的平板記錄具體菌落數(shù)，大于30。CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的 平均數(shù)。
3-4.3其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜釆用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋
2度的菌落數(shù);若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以
2,代表一個平板菌落數(shù)。
3.4.4平板內(nèi)如有鏈狀菌落生長時（菌落之間無明顯界限），應(yīng)將每條鏈（不同來源）作為一個菌落計。
3.5不同稀釋度菌落計數(shù)計算規(guī)則
3.5.1若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值,再將均 值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每毫升中菌落總數(shù)結(jié)果。
3.5.2若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，則總菌落數(shù)按式（1）計算，示例見表 2 SC
4大腸菌群多管發(fā)酵法
4.1培養(yǎng)基和試劑 4.1.1乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液
成分：
蛋白臃
豬膽鹽（或牛、羊膽鹽）
乳糖
漠甲酚紫水溶液（質(zhì)量濃度= 0.04%）
蒸館水
制法:將蛋白臉、膽鹽及乳糖溶于蒸儲水中，調(diào)pH至7.4,加漠甲酚紫溶液，混勻，分裝到帶有倒管 的試管中，每管10 mLo經(jīng)68.96 kPa（115 °C ,10 lb）高壓滅菌20 mino
注：雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸儲水外，其他成分加倍。
4.1.2伊紅美藍瓊脂
成分：
蛋白臃
乳糖
磷酸氫二鉀
瓊脂
伊紅水溶液（質(zhì)量濃度=2 % ）
美藍水溶液（質(zhì)量濃度= 0.5%）
蒸儲水
制法:將蛋白臉、磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸館水中，調(diào)整pH至7.2,分裝到燒瓶內(nèi)。經(jīng)68.96 kPa （115 °C ,10 lb）高壓滅菌20 min,臨用時加入乳糖并加熱熔化瓊脂，冷至50 °C~55 加入伊紅和美藍 溶液，搖勻，傾注平皿。
4.1.3乳糖發(fā)酵管
成分：
蛋白腺 20
乳糖 10
漠甲酚紫水溶液（質(zhì)量濃度-0.04%） 25
蒸館水
制法:將蛋白腺及乳糖溶于水中，調(diào)pH至7.4,加入指示劑，分裝到帶有倒管的試管中，每管3 mL, 經(jīng) 68.96 kPa（115 °C,10 lb）高壓滅菌 20 mino 4.1.4革蘭氏染色液 4.141結(jié)晶紫染色液
成分：
結(jié)晶紫
乙醇（95%,體積分數(shù)）
5金黃色葡萄球菌平皿鑒定法
5.1培養(yǎng)基和試劑
5.1.1胰酪陳大豆肉湯
成分：
胰酪豚（或胰蛋白蹤）
植物蛋白豚（或大豆蛋白蹤）
氯化鈉
磷酸氫二鉀
葡萄糖
蒸饞水
制法:將上述成分混合后，加熱溶解，調(diào)pH為7.2?7.3,分裝，121 °C、20 min高壓滅菌。
結(jié)果報告
凡在上述選擇平板上有可疑菌落生長，經(jīng)染色鏡檢，證明為革蘭氏陽性葡萄球菌，血漿凝固酶試驗 陽性，可報告檢出金黃色葡萄球菌。
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